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兔腫瘤組織巨噬細(xì)胞分離液KIT說明書實(shí)驗(yàn)方法

【產(chǎn)品規(guī)格】

2×200ml/Kit

【產(chǎn)品組成】

為方便廣大用戶使用，試劑內(nèi)容如下：

全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。

1. 首先制備組織單細(xì)胞懸液，制備方法詳見“組織單細(xì)胞懸液制備技術(shù)”。

1. 取一支 15ml 離心管，先加入 3ml 試劑 A 后加入 2ml 試劑 C，制成梯度界面。

1. 用吸管小心吸取組織單細(xì)胞懸液加于分離液液面上，400-550g，離心 20-30min。（注： 根據(jù)組織單細(xì)胞懸液量確定離心條件，組織單細(xì)胞懸液量越大，離心力越大，離心時(shí)間 越長(zhǎng)，具體離心條件需客戶自行摸索，以達(dá)到分離效果）。

1. 離心后，此時(shí)離心管中將出現(xiàn)兩層環(huán)狀乳白色細(xì)胞層。

1. 用吸管小心吸取上層環(huán)狀乳白色目的細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中，向離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118），混勻細(xì)胞。

1. 250g，離心 10min。

1. 棄上清。

1. 用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。

1. 250g，離心 10min。

1. 重復(fù) 7、8、9，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。

1. 差異貼壁法純化細(xì)胞 （1）用巨噬細(xì)胞無血清培養(yǎng)基（產(chǎn)品編號(hào)：CTBD2015MAC）或巨噬細(xì)胞*培養(yǎng)基 （產(chǎn)品編號(hào)：HCTBD2015MAC）以 1.5-3×10⁶ 個(gè)/ml 的密度重懸細(xì)胞，將細(xì)胞鋪于一次 性細(xì)胞板或細(xì)胞瓶中，放于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。

（2）2-4 小時(shí)內(nèi)貼壁的為巨噬細(xì)胞前體（俗稱為單核細(xì)胞）。 （3）10-24 小時(shí)內(nèi)貼壁的單個(gè)核細(xì)胞為內(nèi)皮、內(nèi)皮祖細(xì)胞、干細(xì)胞。 （4）不貼壁的為淋巴細(xì)胞。

注：

1. 無血清培養(yǎng)基中不含任何動(dòng)物成分，為得到更佳培養(yǎng)效果可添加 10%自體血漿或 2-8% 經(jīng)篩選的胎牛血清。

1. *培養(yǎng)基中含 2-20%胎牛血清（血清具體含量由所培養(yǎng)的目的細(xì)胞而定）。

1. 由于每種細(xì)胞的貼壁時(shí)間存在差異可將所得細(xì)胞分開已達(dá)簡(jiǎn)單的純化目的，此法成

本相對(duì)較低。如需獲得高純度目的細(xì)胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽性或陰

性分選。

【注意事項(xiàng)】

1. 全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。為獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，zui 好在取樣 2h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，樣品存放時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞分離效果越差。樣品放置超過 6h 后 分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。

1. 本實(shí)驗(yàn)不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應(yīng)使用無靜電、低靜電離 心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品，因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面 會(huì)變成毛面，影響細(xì)胞分離效果。

1. 吸取過多的乳白色細(xì)胞層及分離液層會(huì)導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的

粒細(xì)胞數(shù)量增加。

1. 分離液用量大于組織單細(xì)胞懸液樣本時(shí)，分離效果更佳。

1. 如實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞得率或活性過低，請(qǐng)以尋求幫助，具體詳 見下方生產(chǎn)企業(yè)信息。

【儲(chǔ)存條件及有效期】

18-25℃保存，有效期 2 年。本品易感染細(xì)菌，需無菌條件操作。無菌條件下操作，啟

封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。

【參考值（參考范圍）】

本實(shí)驗(yàn)巨噬細(xì)胞提取率大于 80%。

下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例，用戶可適當(dāng)進(jìn)行參考。

【相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案】

1. 組織單細(xì)胞懸液制備技術(shù)。

1. 所獲得巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。

1. 所獲得巨噬細(xì)胞的核酸提取技術(shù)。

1. 所獲得巨噬細(xì)胞的鑒定方法 A.流式細(xì)胞技術(shù) B.免疫組化技術(shù) C.原位雜交技術(shù)

D.PCR 技術(shù)

注：上述技術(shù)方案詳情請(qǐng)登陸本搜索“細(xì)胞分離、

純化、擴(kuò)增、鑒定及生物治療技術(shù)手冊(cè)”，并在說明書項(xiàng)目欄下下載使用。

【可能存在的問題及解決方法】

1.    由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示：

1. 本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地 區(qū)客戶可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對(duì)離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。建議對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，恒定離 心時(shí)間，對(duì)離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整。

1. 本分離液依照標(biāo)準(zhǔn)，全部使用藥用級(jí)原料，性能指標(biāo)與國(guó)產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同，可 能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不*的情況，可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。

注：在對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù)，直至達(dá)到分離效果，

離心力zui小不得小于 400g，zui大不得大于 1200g。離心時(shí)間以 20-30min 為準(zhǔn)。